Chromatographie liquide HPLC : colonnes et techniques

L’HPLC (High Performance Liquid Chromatography) est une technique chromatographique dont la phase mobile est liquide. Cette méthode de pointe qui est utilisée en chimie analytique permet de séparer et d’identifier les constituants d’un mélange. Elle a de nombreuses applications : recherche de molécules organiques dans l’eau tels que les pesticides,  contrôle de routine dans l’industrie pharmaceutique, etc…

Les différentes techniques en HPLC

En fonction du type de la phase stationnaire, la méthode de séparation est différente :

  • chromatographie de partage : c’est la plus utilisée des techniques avec une phase stationnaire apolaire (colonnes du type C18) et un solvant polaire. La phase stationnaire et la phase mobile sont toutes les 2 liquides. La séparation s’effectue suivant les coefficients de partage des solutés dans les différentes phases.
  • chromatographie d’échange d’ions : technique utilisée pour la séparation de solutés ionisés ou ionisables
  • chromatographie d’exclusion : également appelée à « perméation de gel ». La séparation s’effectue suivant la taille des molécules organiques.
  • chromatographie d’adsorption : la phase stationnaire des colonnes est constituée d’une phase polaire (gel de silice) sur laquelle les molécules viennent s’adsorber et sont plus ou moins retenues suivant leur affinité. L’HPLC est utilisée pour l’identification, le dosage ou pour des contrôles de routine tels que la vérification de formulation médicamenteuse par comparaison avec un chromatogramme témoin.

Colonnes et détection

Colonne d'HPLC

Colonne d’HPLC

La colonne est un élément majeur en HPLC. Elles sont généralement constituées d’un tube en acier de 5 à 10 cm supportant des pressions de plus de 400 bars. Des précautions d’utilisation doivent être prises pour assurer une bonne durée de vie de cette pièce et permettre une validation correcte de la technique. Il faut notamment s’assurer d’utiliser des solvants compatibles avec ceux présents dans la colonne et respecter la gamme de pH préconisée par le fabricant.

Dans le cas des colonnes apolaires utilisées en chromatographie de partage, l’élution des composés du mélange s’effectue suivant leur polarité. Un solvant polaire entraînant plus facilement les composés polaires.

La détection des composés est basée sur l’absorption UV. Les détecteurs à barrette de diode permettent de couvrir une large gamme UV et sont donc avantageux.

La chaine HPLC comprend également une pompe qui permet de « pousser » le solvant à travers la colonne.

Avancées technologiques

Désormais, les HPLC sont fréquemment couplées avec un détecteur à spectrométrie de masse qui permet d’avoir des informations sur la molécule éluée ( masse molaire, étude des fragments permettant d’identifier le composé, etc…)

Le temps étant précieux en analyse chimique, les dispositifs de chromatographie permettent de monter à de hautes pressions (600 bars) ce qui permet de limiter considérablement le temps d’analyse tout en gardant une bonne résolution.

Consultez le site Lachimie.fr Pour en savoir plus sur les techniques chromatographiques

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Auteur : La rédaction

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